各省、自治區(qū)、直轄市食品藥品監(jiān)督管理局（藥品監(jiān)督管理局）：

　　為規(guī)范疫苗研發(fā)行為，指導疫苗研究單位科學地開展研究工作，根據(jù)《藥品管理法》、《藥品管理法實施條例》及《藥品注冊管理辦法》，我局組織制定了《預(yù)防用疫苗臨床前研究技術(shù)指導原則》、《生物制品生產(chǎn)工藝過程變更管理技術(shù)指導原則》、《聯(lián)合疫苗臨床前和臨床研究技術(shù)指導原則》、《多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導原則》、《結(jié)合疫苗質(zhì)量控制和臨床研究技術(shù)指導原則》和《預(yù)防用疫苗臨床試驗不良反應(yīng)分級標準指導原則》等6個技術(shù)指導原則，現(xiàn)印發(fā)給你們，并請轉(zhuǎn)發(fā)轄區(qū)內(nèi)各有關(guān)單位。

國家食品藥品監(jiān)督管理局
二○○五年十月十四日

預(yù)防用疫苗臨床前研究技術(shù)指導原則

前言

　　由病毒、細菌或其他病原微生物為起始材料，經(jīng)培養(yǎng)增殖制成的減毒、滅活的病原體，或再經(jīng)純化、裂解、亞單位（包括細菌類毒素）等方法處理制備的富含免疫原性，刺激機體產(chǎn)生特異性免疫學反應(yīng)而達到預(yù)防某種疾病的產(chǎn)品，為預(yù)防用疫苗。

　　本指導原則適用于用病毒、細菌或其他病原微生物制備的預(yù)防用疫苗，其目的是為該類制劑提供一個共同的原則，指導制定臨床前研究的方案，和確定具體的研究內(nèi)容。

一、基本原則

　　（一）應(yīng)符合國家《藥品管理法》等相關(guān)法律法規(guī)的要求；

　　（二）對所預(yù)防的疾病的流行情況進行研究，包括疾病的危害程度 所涉及的人群及病原的型和亞型等；

　　（三）對研制該類制品用于預(yù)防疾病的有效性、安全性及必要性進行分析；

　　（四）應(yīng)對該制品用于預(yù)防該疾病的利益風險比進行研究。根據(jù)該制品的預(yù)防方案可能達到的效果及可能出現(xiàn)的副作用或危害，對總體的利弊權(quán)衡進行評價，并提出擬采取避免或減少其危害性或副作用的措施。這種評價將是該方案能否獲得批準的重要依據(jù)之一。

二、用于疫苗研究用的菌毒種

　　研究疫苗所用的菌毒種必須證明為引起本病的細菌、病毒或其他病原體，如該菌毒株分離自人體，下述內(nèi)容必須清楚。

　　（一）菌毒株名稱及來源：

　　1．菌毒株名稱

　　2．菌毒株來源

　　（1）分離菌毒株的宿主一般情況；

　　（2）發(fā)病地點、發(fā)病日期；臨床確診日期、實驗室確診日期；病人病程及病人轉(zhuǎn)歸。

　　3．菌毒株分離原樣本： 咽試子、漱口液、痰液、血液、糞便、尿液、尸解標本的組織名稱；取樣日期；取樣時病人的病期。

　　4．鑒于人類的血液在同一時間內(nèi)較少感染多種病毒或細菌，而咽試子、漱口液、痰液、尿液、糞便等樣品難免污染其他外源因子，因此用病人血液分離的菌、毒株較適宜用于研究疫苗。

　　5．分離菌、毒株的其他自然樣本名稱、來源、數(shù)量、取樣方法等。

　　（二）菌、毒株分離過程

　　1．用細胞分離病毒，所用細胞名稱、代次、來源應(yīng)清楚，應(yīng)進行細胞無菌檢測、支原體和外原因子等檢測；病毒分離不宜使用腫瘤原性的細胞系。盡可能使用非腫瘤原性細胞，如人二倍體細胞或Vero細胞等。

　　2．用動物分離病毒，對所用動物名稱、品系、級別、年齡、接種途徑、飼養(yǎng)條件和制備毒種的動物臟器名稱等須詳細記載；如再適應(yīng)到細胞，則還應(yīng)參照上述對分離用細胞的要求。

　　3．確定分離菌株所用培養(yǎng)基名稱、種類，以及分離培養(yǎng)的溫度和條件。

　　（三）菌、毒株分離傳代特性

　　應(yīng)包括樣品處理方法、首次盲傳確證菌毒株陽性代次、菌毒株確證檢定方法、每代培養(yǎng)天數(shù)、病毒滴度、滴定方法、動物是否發(fā)病或死亡等資料。

　　（四）菌毒種建立和保存

　　應(yīng)包括原始菌毒種代次、滴度，添加的保護劑的名稱和濃度、存儲條件等資料；原代菌毒種是指已適應(yīng)到可生產(chǎn)疫苗的細胞或培養(yǎng)基，可穩(wěn)定傳代、保留抗原性、并經(jīng)過檢定可用于疫苗生產(chǎn)的菌毒種。種子批的建立應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》“生物制品制品檢定用菌毒種管理規(guī)程”的要求，應(yīng)對種子批進行菌毒種的傳代和限定代次的研究，以證明主種子和工作種子批在規(guī)定代次內(nèi)的生物學特性與原始菌毒種的一致性。

　　（五）菌毒種的檢定

　　1．鑒別試驗：可采用血清學、生物學、核酸序列分析等方法證明為該菌毒種。明確該病原體及其它相關(guān)生物分子的基因序列及結(jié)構(gòu)，并與我國主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性進行分析以及明確其血清型、亞型和/或基因型，對該種基因型或血清型的流行情況進行分析，若存在不同的血清型或基因型，應(yīng)對所選擇的血清型或基因型與其它血清型或基因型交叉反應(yīng)或交叉保護性進行分析和研究。

　　2．無菌檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的要求進行，應(yīng)符合規(guī)定。

　　3．外源因子檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求進行，應(yīng)符合規(guī)定，取樣量應(yīng)足夠檢測試驗的需要。

　　4．擴增能力和感染性滴度：應(yīng)能達到按生產(chǎn)工藝要求順利生產(chǎn)合格疫苗的要求。應(yīng)建立測定菌毒種擴增能力和感染性滴度的方法和標準，并提供這些擴增能力和感染性滴度與疫苗有效性之間的相關(guān)性數(shù)據(jù)。

　　5．免疫原性檢查：菌毒種的免疫原性是衡量該疫苗是否有效的重要指標，應(yīng)制定和建立測定菌毒種免疫原性的有效方法和標準，以評估該候選菌毒種能否進行疫苗生產(chǎn)。

　　6．減毒特性

　　（1）如研制減毒活疫苗應(yīng)對原始菌毒株的生物學、血清型、基因型和免疫原性進行研究；減毒方法、減毒過程、減毒程度和減毒后的生物學、血清型、基因型和免疫原性，并進行減毒前后的特性對比，尤其要對減毒后的安全性和免疫原性作出確切的結(jié)論；

　　（2）應(yīng)建立減毒特性指標的驗證方法、動物模型和減毒后安全性的標準以及檢測和警戒毒力回復的依據(jù)等；

　　（3）對制備注射劑的減毒活疫苗，除一般的外源因子檢測外，還應(yīng)驗證無逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染。該驗證方法可采用PERT法；

　　（4）如已知該病毒具有嗜神經(jīng)毒性，其驗證要求可參考《IABS Scientific workshop on neurovirulence test for live virus vaccines， WHO，31 January 2005》。

三、疫苗的生產(chǎn)工藝研究

　　（一）建立菌毒種庫

　　應(yīng)建立三級種子庫。對種子庫的遺傳穩(wěn)定性進行分析，明確該種子庫可以傳代的次數(shù)。生產(chǎn)用菌毒種、細胞和涉及生產(chǎn)的工藝技術(shù)應(yīng)注意專利，應(yīng)進行相關(guān)專利查詢。

　　（二）生產(chǎn)用細胞和/或培養(yǎng)基

　　1．生產(chǎn)用細胞應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》中“生物制品生產(chǎn)用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”的要求，如用傳代細胞系應(yīng)建立三級細胞庫；

　　2．生產(chǎn)用培養(yǎng)基盡可能避免使用動物來源和可能引起人體不良反應(yīng)的原材料，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性原材料。

　　（三）疫苗原液生產(chǎn)工藝的研究

　　1．生產(chǎn)工藝的主要技術(shù)參數(shù)的確定

　　（1）病毒與細胞的接種比例、MOI的最佳參數(shù)、細胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的最佳溫度、培養(yǎng)時間和收獲時間。菌毒種的接種量，培養(yǎng)和發(fā)酵條件等技術(shù)參數(shù)的研究確定；

　　（2）滅活劑的選擇和依據(jù)；

　　（3）滅活或裂解條件及滅活或脫毒效果的驗證，滅活效果驗證的依據(jù)、方法；滅活效果的驗證，應(yīng)采用盡可能敏感的細胞或培養(yǎng)基和方法進行；

　　（4）原液的濃縮和/或活性抗原的提取純化等工藝研究：純化和提取工藝中各種條件進行優(yōu)化，純化和提取工藝對抗原活性成分是否影響，應(yīng)建立穩(wěn)定的純化工藝，包括純化時的回收率、抗原活性和純度等的穩(wěn)定性；并制定相應(yīng)的質(zhì)控指標和檢測方法，按GMP要求在符合GMP要求的生產(chǎn)環(huán)境下生產(chǎn)；

　　（5）初步確定起始投料、原液、半成品和成品的產(chǎn)出比的理論數(shù)據(jù)。

　　2．疫苗對佐劑的要求

　　目前能用于疫苗的佐劑多為氫氧化鋁，而鋁佐劑通常使疫苗產(chǎn)生的抗體滯后，且增加注射局部的副反應(yīng)機率。如疫苗的抗原能滿足免疫的需要，則不加佐劑為宜。如果在終制品中使用佐劑，則對以下問題應(yīng)進行研究，對于已經(jīng)明確有佐劑效應(yīng)或者已經(jīng)商品化的佐劑，只需提供該類制劑的組分或化學組成，國內(nèi)外使用該類制劑的情況，無需再進行毒理和安全性研究。若國內(nèi)外均未使用過該類佐劑，則必須對其作用原理、安全性及佐劑效應(yīng)進行詳細的研究并建立切實可行的評價方法。

　　（四）疫苗的配方研究

　　應(yīng)對疫苗的配方進行研究，如疫苗中添加的穩(wěn)定劑成分，緩沖液、佐劑、以及凍干疫苗的賦形劑成分等是否對疫苗造成影響。

四、藥理、毒理和生物分布

　　疫苗不同于一般的化學藥品，藥理、毒理的實驗要求具有特殊性，因此，該制品的藥理學試驗主要包括發(fā)生作用的原理、生物效價與劑量的關(guān)系、免疫程序和接種途徑與效果的關(guān)系等；在毒理學方面主要考慮接種部位和全身的病理反應(yīng)、以及機體對該疫苗的非期望的免疫應(yīng)答反應(yīng)和這種反應(yīng)的持續(xù)時間。由于以上各方面是互相關(guān)聯(lián)的，因此，應(yīng)綜合考慮藥理、毒理和免疫原性或生物效價的因素。

　　應(yīng)建立適當?shù)脑囼灱皺z測方法來評價疫苗的免疫原性或生物效價，如果有動物模型或可建立動物模型的，可以采用動物模型直接評價疫苗的生物效價，如：對一些有動物模型的感染性疾病，可以采用病原體的攻擊實驗來評價該疫苗的保護效果。而且要建立劑量與生物效價的關(guān)系，通過實驗優(yōu)化免疫程序和接種途徑。若無法建立動物模型，應(yīng)建立能驗證該疫苗有效性的體外實驗進行評價。

　　滅活疫苗的生物分布較難檢測和評價。減毒活疫苗的生物分布應(yīng)建立敏感的動物模型，可測定接種疫苗后的病毒血癥（或菌血癥）以及持續(xù)時間，排毒（菌）方式和途徑，對是否呈現(xiàn)體內(nèi)復制及感染的器官組織細胞應(yīng)進行詳細的研究。

五、質(zhì)量控制及檢定的要求

　　（一）生產(chǎn)過程中質(zhì)量監(jiān)控標準的建立及要求

　　在生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)和步驟中的產(chǎn)品均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標準，以便后續(xù)工藝的進行，保證產(chǎn)品的質(zhì)量、工藝的穩(wěn)定性。

　　（二）產(chǎn)品的質(zhì)量檢定與要求

　　1．外觀檢查：根據(jù)樣品的特征建立外觀的質(zhì)量標準。

　　2．pH值檢測：可根據(jù)一般生物制品的要求建立標準，一般為7.2±0.5.

　　3．純度：主要用于評價純化制品中含有有效成分的量和雜質(zhì)的最低限量，制定相應(yīng)標準，通常可測定有效抗原在疫苗中的絕對值或測定主要雜質(zhì)的量推算有效抗原在疫苗中的相對值。

　　4．宿主細胞 DNA和蛋白殘留量檢測：采用傳代細胞生產(chǎn)疫苗，應(yīng)限制疫苗中的宿主細胞DNA和蛋白殘留量，進行方法研究時應(yīng)建立相應(yīng)的標準品，并對檢測試劑的敏感性和特異性進行驗證。疫苗中殘余宿主細胞DNA及蛋白殘留量可參考現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求。

　　5.無菌檢查：應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求。

　　6．熱原或細菌內(nèi)毒素檢查：可參照現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求進行； 也可以用其它方法檢測疫苗中的熱原物質(zhì)。

　　7．抗生素檢測：預(yù)防用疫苗在生產(chǎn)過程中不得添加青霉素或其他β內(nèi)酰氨類抗生素；如在生產(chǎn)過程中添加除上述以外的其他抗生素，應(yīng)建立相應(yīng)的檢測方法并規(guī)定抗生素殘留量的要求。

　　8．滅活效果的驗證：由于制備疫苗的病原體一般均對人類致病，因此應(yīng)建立有效的滅活方法對該制品中的病原體進行滅活，并應(yīng)對滅活效果進行驗證；在成品檢定中應(yīng)建立滅活劑殘留量檢測的方法和限度標準。

　　9．異常毒性檢查：應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求。

　　10．穩(wěn)定性試驗：是指疫苗在常規(guī)保存溫度下的穩(wěn)定性試驗。由于穩(wěn)定性試驗的結(jié)果直接與制品的效期有關(guān)，且試驗觀察時間較長，因此應(yīng)在生產(chǎn)工藝確定后盡早留樣進行，定期取樣測定制品效力和其他相關(guān)的質(zhì)量指標；對穩(wěn)定性試驗結(jié)果與加速穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)進行分析對比，可為正式產(chǎn)品的有效期確定提供依據(jù)。

　　11．效力試驗（生物效價）：由于用于預(yù)防的疫苗是通過機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)生作用的，因此應(yīng)評價其體液免疫和細胞免疫的生物效價。在評價體液免疫效價時，應(yīng)選擇實驗動物的品系，建立檢測動物血清抗體的診斷試劑，并對該類試劑進行驗證，可以計算小鼠ED50以及抗體產(chǎn)生的滴度，如有必要和可行，還應(yīng)當建立評價抗體質(zhì)量的方法，對抗體的性質(zhì)進行評價，如亞型測定及抗原中和位點分析等；在評價細胞免疫效價時，應(yīng)當建立檢測評價細胞免疫的方法（如特異性CTL反應(yīng)的方法或Elispot方法等），也可通過對細胞因子的定量檢測評價其細胞免疫情況，如屬于常規(guī)檢定項目，該類方法應(yīng)穩(wěn)定、重復性好、可操作性強，并制定相應(yīng)的質(zhì)量標準。若有動物模型，可進行動物保護性實驗。

　　12．佐劑的質(zhì)量評價：如最終制品含有佐劑，則應(yīng)建立佐劑含量以及與之結(jié)合率的檢測方法，并制定相應(yīng)質(zhì)量標準。

　　13．疫苗標準品或參考品的研究：對于一種新疫苗而言，建立檢測疫苗的效力、免疫原性或毒性用標準品或參考品對判斷驗室研究階段與批量投產(chǎn)后的疫苗質(zhì)量是否一致以及臨床試驗的評價是非常重要的。

六、臨床研究用樣品要求

　　（一）申請臨床試驗用的疫苗，按照國家GMP的要求，在符合現(xiàn)行中國藥品GMP的生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的。

　　（二）臨床試驗用疫苗樣品應(yīng)盡量使用與臨床前研究相同批的疫苗，其批量一般不少于1000人份，并能滿足臨床試驗對疫苗量的要求。

　　（三）進行臨床試驗的疫苗必須由中國藥品生物制品檢定所進行質(zhì)量復核。

生物制品生產(chǎn)工藝過程變更管理技術(shù)指導原則

前言

　　本指導原則適用于已經(jīng)取得生產(chǎn)文號的生物制品生產(chǎn)過程等發(fā)生變更的管理技術(shù)指導原則，所指生物制品生產(chǎn)過程變更是指生產(chǎn)者對已獲國家藥品管理當局批準的生產(chǎn)全過程中的任何過程所進行的任何變動。包括從開始生產(chǎn)至終產(chǎn)品的全過程，及與生產(chǎn)相配套的輔助設(shè)施。其中包括原液制備，半成品配制及成品分裝等；變更后需重新申報按新藥管理的或重新申請生產(chǎn)文號的不包括在此范圍之內(nèi)。

　　本指導原則首先以國家頒布的相關(guān)法規(guī)及技術(shù)指導原則為基礎(chǔ)，并應(yīng)符合國家的相關(guān)要求，如國家現(xiàn)行GMP規(guī)范要求。

一、原則

　　（一）任何生產(chǎn)過程的改動都是以提高產(chǎn)品的安全性和有效性為基本出發(fā)點，在提高或至少不改變最初國家批準產(chǎn)品安全性和有效性的基礎(chǔ)上進行相關(guān)改進。

　　（二）擬進行生產(chǎn)過程變更的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)向SFDA提出申請，并遞交相關(guān)方案和資料，提供證明資料，說明該變更不引起產(chǎn)品質(zhì)量的內(nèi)在變化，由SFDA組織專家進行審查并確定變更的類型及應(yīng)遞交的相關(guān)材料。

二、概述

　　（一）生產(chǎn)過程變更：根據(jù)其對終產(chǎn)品質(zhì)量的影響，一般分為以下3種情況。

　　1、變更引起產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量發(fā)生改變的，需要按新藥申報程序進行申報為I類，請參考《藥品注冊管理辦法》附件4藥品補充申請注冊事項及申報資料要求；

　　2、變更可能對產(chǎn)品的安全和有效性有影響的為II 類，需報SFDA審批；

　　3、一般不影響產(chǎn)品安全性和有效性的為III 類，需報SFDA備案。詳見下表。

生產(chǎn)變更分類表

───────────────────────────────
　　　　　　　　　生產(chǎn)變更內(nèi)容　　　　　　　　　　　　　類　型
───────────────────────────────
一、主要原輔材料
　　原料或起始原材料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　培養(yǎng)基或其主要成份　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　關(guān)鍵原輔料的來源　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　牛血清及胰酶等　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
二、菌毒種庫及細胞庫
　　原始種子庫　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　主代種子庫　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　工作種子庫　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　III
三、生產(chǎn)工藝
　　減少或增加工藝步驟　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　病毒滅活方法變更　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　培養(yǎng)時間變更　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　分離、純化方法變更　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　參數(shù)變更　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　緩沖液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　III
　　生產(chǎn)規(guī)模改變　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
四、配制
　　防腐劑　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　佐劑（新佐劑除外）　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　賦型劑　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　穩(wěn)定劑　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
　　稀釋劑（新稀釋劑除外）　　　　　　　　　　　　　　　　III
五、成品
　　檢定方法　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
　　質(zhì)量標準　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
六、主要生產(chǎn)設(shè)備（如消毒、凍干、分裝、發(fā)酵罐血液制品生產(chǎn)　I
　　用離心機、壓濾機）
　　一般生產(chǎn)設(shè)備　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　II
───────────────────────────────

　　（二）生產(chǎn)過程變更均應(yīng)進行相關(guān)的技術(shù)評價，并應(yīng)進行驗證。

　　1．原材料或起始原材料

　　2．培養(yǎng)基主要成份

　　3．菌毒種、細胞株主代種子庫

　　4．生產(chǎn)工藝部分變更，如增加、減少分離步驟或由精制改為柱層析

　　5．病毒滅活方法變更

　　6．培養(yǎng)時間改變

　　7．分離、純化方法的變更

　　8．緩沖液、參數(shù)改變；

　　9．生產(chǎn)規(guī)模改變（單批10倍以上規(guī)模）

　　10．主要生產(chǎn)設(shè)備的變更（如消毒、凍干、分裝、發(fā)酵罐、血液制品生產(chǎn)用離心機、壓濾機）

　　11．防腐劑、佐劑、輔料；

聯(lián)合疫苗臨床前和臨床研究技術(shù)指導原則

前言

　　聯(lián)合疫苗是指含有二個或多個活的、滅活的生物體或者提純的抗原，由生產(chǎn)者聯(lián)合配制而成，用于預(yù)防多種疾病或由同一生物體的不同種或不同血清型引起的疾病。如果將載體疫苗和偶聯(lián)疫苗的載體菌或偶聯(lián)的載體成分所引起的疾病也作為其適應(yīng)癥時，則載體疫苗和偶聯(lián)疫苗也屬于聯(lián)合疫苗。

　　在本指導原則中根據(jù)聯(lián)合疫苗的研究經(jīng)驗和結(jié)果，提出了有關(guān)臨床前研究和臨床研究中應(yīng)注意的問題和要求。論及的內(nèi)容不可能面面俱到，在實際應(yīng)用中可能會遇到許多技術(shù)問題，對于特定問題和特定的制品，應(yīng)視具體問題具體研究決定。本指導原則亦將隨科學技術(shù)發(fā)展和經(jīng)驗積累而逐步完善。

一、聯(lián)合疫苗研究開發(fā)中應(yīng)考慮的問題

　　聯(lián)合疫苗的研發(fā)過程中，應(yīng)對聯(lián)合后疫苗各組分間的相互作用，以及防腐劑、佐劑和非活性成分等對聯(lián)合后活性成分的影響等進行研究。應(yīng)證明聯(lián)合后的疫苗在安全性和有效性方面至少與單價疫苗是相等的。

　　（一）組分間的相容性

　　以往的經(jīng)驗表明，單價疫苗在聯(lián)合后會使疫苗的安全和效力發(fā)生改變。有時聯(lián)合疫苗中的某種成分會對其他的一種或多種活性組分起到抑制或增強的作用，例如：當全細胞百日咳疫苗與滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗（IPV）聯(lián)合后會使百日咳的效力下降；另外，當用活疫苗配制聯(lián)合疫苗時，可產(chǎn)生病毒間或病毒亞型間的免疫干擾，其免疫應(yīng)答比單病毒組分疫苗的免疫應(yīng)答要低；由活疫苗配制的聯(lián)合疫苗，也可能發(fā)生組分間的重組反應(yīng)，可能使減毒活疫苗毒力回復。因此，在開展臨床試驗前，應(yīng)對聯(lián)合疫苗中各組分間的相容性進行驗證。應(yīng)采用適宜的理化、生化和生物學檢測方法，對制品的特性和組分的完整性進行測定。為了進一步證明組分間的相容性，在臨床前的研究中，應(yīng)采用適當?shù)膭游锬Ｐ停_定聯(lián)合后對各組分的效力和免疫原性是否有影響。還應(yīng)當考慮到聯(lián)合疫苗中的每一組分都有可能通過聯(lián)合使毒力回復。因此，應(yīng)當測定組分在單價時和聯(lián)合時是否有恢復變異的趨勢。同時，還應(yīng)評價制品的再懸浮的影響，以及容器和瓶塞與聯(lián)合疫苗是否相匹配。

　　（二）防腐劑對聯(lián)合疫苗的影響

　　防腐劑或穩(wěn)定劑有可能改變疫苗的效力，如DTP-IPV中的硫柳汞可抑制IPV的效力；應(yīng)考慮防腐劑對組分毒性逆轉(zhuǎn)的影響，還應(yīng)考慮定量測定各成分或抗微生物物質(zhì)的殘余量，以及進行防腐劑對成品抗污染能力的研究。

　　（三）佐劑對聯(lián)合疫苗的影響

　　應(yīng)研究佐劑與其他組分間的相容性及對每一成分的吸附度，同時還應(yīng)考慮多個組分若同時吸附時的吸附效率和動力學。對于未被吸附（游離）的組分在配制后吸附情況，例如未被吸附的組分是否會被吸附；已吸附的組分是否會被解離下來，即研究存放時間對佐劑吸附抗原的影響等。對于以前未被吸附過的組分，應(yīng)研究吸附后對檢測方法和檢測結(jié)果是否會產(chǎn)生影響，應(yīng)了解對鑒別試驗或熱原試驗方面的影響。

　　（四）非活性成分對聯(lián)合疫苗的影響

　　在配方的開發(fā)階段，應(yīng)當測定不同的緩沖液、鹽類、穩(wěn)定劑（比如乳糖、明膠、山梨醇等）以及其他化學因素是否對疫苗的安全性、純度或效力產(chǎn)生有害的相互作用。

　　（五）穩(wěn)定性和有效期

　　在穩(wěn)定性和有效期的研究時，應(yīng)使用三批成品考核實際貯存時間內(nèi)制品的穩(wěn)定性，以制定該制品的有效期。由于疫苗的有效期是從成品的效力試驗開始計算的，所以還應(yīng)考慮以下三個方面對疫苗有效期的影響，即生產(chǎn)過程中和配制前每一組分的保存時間、效力試驗開始前后的聯(lián)合疫苗的保存時間。聯(lián)合疫苗的有效期的開始時間應(yīng)當是從測定聯(lián)合疫苗中的第一個組分的最后一次有效的效力試驗開始（或合格）之日。按有效期最短的組分確定聯(lián)合疫苗的有效期，即應(yīng)綜合考慮各組分的有效期。所制定的成品有效期應(yīng)當確保制品在其總有效期內(nèi)（即有效期開始前的貯存期加上成品的有效期）各組分都是穩(wěn)定和合格的。

二、聯(lián)合疫苗生產(chǎn)中應(yīng)考慮的問題

　　生產(chǎn)過程中應(yīng)考慮的主要問題是生產(chǎn)的一致性，即生產(chǎn)的穩(wěn)定性，應(yīng)證明在已確定的生產(chǎn)條件下生產(chǎn)出的產(chǎn)品是穩(wěn)定和一致的。

　　（一）連續(xù)批的數(shù)量和規(guī)模

　　用于穩(wěn)定性研究的成品最好是用連續(xù)三批原液配制的，應(yīng)在規(guī)模化的生產(chǎn)設(shè)施中進行，至少有一批是在大規(guī)模生產(chǎn)狀態(tài)下生產(chǎn)的，以表明該生產(chǎn)工藝在其生產(chǎn)規(guī)模改變時是否會對產(chǎn)品的安全、純度和效力產(chǎn)生影響，尤其對于吸附類產(chǎn)品和不易再懸浮的產(chǎn)品，其成品的質(zhì)量有可能受到吸附效率或者聯(lián)合步驟的影響。

　　（二）單價組分混合時應(yīng)考慮的問題

　　在配制聯(lián)合疫苗時每一種抗原應(yīng)至少使用三批，但對已獲生產(chǎn)文號的抗原（單價疫苗）可少于三批，沒有必要對聯(lián)合疫苗中所有組分的連續(xù)批進行聯(lián)合配比的測定，但應(yīng)當證明疫苗中每一抗原組分的生產(chǎn)一致性。可采用下述聯(lián)合配比方法的距陣表或采用隨機采樣法，例如：X、Y、Z等組分配制的聯(lián)合疫苗可采用每一組分的第一批聯(lián)合后得到成品為第一批，即X1+Y1+Z1+……N1配制得到最終成品為批號1，X2+Y2+Z2+……N2配制得到最終成品為批號2，X3+Y3+Z3+……N3配制得到最終成品為批號3.采用這種方式配制可減少成品的批數(shù)。

三、聯(lián)合疫苗檢定中應(yīng)考慮的問題

　　（一）一般要求

　　對生產(chǎn)的每一批制品都要進行檢測，證明其質(zhì)量達到了相應(yīng)的質(zhì)量標準，以保證制品在安全、純度和效力方面的質(zhì)量。如果目前尚無令人滿意的聯(lián)合疫苗檢測方法，應(yīng)盡快開發(fā)新的檢測方法，以測定每一種組分的含量或效價。

　　（二）效力試驗

　　應(yīng)當測定聯(lián)合疫苗中各有效組分的效力，其效價應(yīng)當達到單價制品的規(guī)程要求。如果不能達到規(guī)程要求時，應(yīng)證明其效價降低是由于聯(lián)合疫苗中組分間的相互作用所致，并證明降低的效價不會導致人群免疫后低的免疫應(yīng)答。如果已經(jīng)證明后序的生產(chǎn)工藝對原液的效價沒有影響時，可以用對原液的效價測定代替對成品的效價測定，但凍干制品必需對成品進行效價測定。對含有佐劑的疫苗，抗原的吸附度對制品的效價會產(chǎn)生較大的影響，因此應(yīng)測定成品的效力。效力試驗應(yīng)能證實組分間的相互作用使某一種組分對其他組分產(chǎn)生增強或減弱作用。效力試驗可以用動物免疫原性試驗，對每一種抗原的免疫應(yīng)答以及應(yīng)答的質(zhì)量都應(yīng)進行研究，這些研究應(yīng)當包括測定抗體的分類、親和力、親和性、抗體動態(tài)變化或功能，例如測定中和靶抗原或毒素的能力。最好是用動物試驗比較聯(lián)合疫苗與單個抗原的免疫應(yīng)答情況，以確定是否發(fā)生了免疫應(yīng)答的增強或抑制現(xiàn)象。同樣，也應(yīng)在動物免疫原性研究中測定活疫苗株之間的免疫干擾現(xiàn)象。

　　對于一個新的疫苗或者聯(lián)合疫苗中含有人體未曾使用過的新抗原，只要有動物模型，就應(yīng)當首先用動物模型對其保護力進行研究。保護力試驗應(yīng)當采用擬預(yù)防疾病的有毒株來攻擊。應(yīng)當按照經(jīng)統(tǒng)計學和經(jīng)科學驗證的試驗步驟對試驗結(jié)果進行確認，并應(yīng)詳細描述。此項試驗應(yīng)在產(chǎn)品的開發(fā)早期進行。

　　（三）鑒別試驗

　　應(yīng)對聯(lián)合疫苗中每一活性組分進行檢定，目的是證明制品的內(nèi)容物與其標簽的標示相一致。

　　（四）無菌檢查

　　聯(lián)合疫苗中的各組份以及成品疫苗均應(yīng)符合無菌試驗的要求。對含有殘余抗生素、含有未曾使用過的防腐劑或含有顆粒狀佐劑的制品，對其半成品和成品的無菌試驗應(yīng)進行研究，并建立適宜于這些制品的無菌試驗方法。

　　（五）純度試驗

　　聯(lián)合疫苗中每一種組分均應(yīng)達到該組分的純度要求，如Hib－DTP偶聯(lián)疫苗中的Hib組分，即使與已知含有內(nèi)毒素的DTP配制成聯(lián)合疫苗，也應(yīng)當符合Hib制品熱原試驗的要求。在此種情況下則不要求對成品進行熱原檢查。此外，對組分進行純度測定用的SDS-PAGE檢測，也不適用于成品。

四、聯(lián)合疫苗臨床研究中應(yīng)注意的問題

　　聯(lián)合疫苗的臨床研究與其他疫苗一樣首先應(yīng)遵循《藥品臨床試驗管理規(guī)范》（GCP）的要求。由于聯(lián)合疫苗是多組分的，在臨床研究中對于安全性和有效性的研究與單一成分的疫苗有所不同，應(yīng)注意以下幾方面的問題。

　　（一）安全性研究

　　一般來講，聯(lián)合疫苗的安全性研究是與同時在不同部位接種聯(lián)合疫苗中的每一種單價組分疫苗進行比較，例如，接種DTP-HB疫苗與分別接種DTP和HB疫苗進行比較。臨床試驗應(yīng)是隨機的，且應(yīng)設(shè)對照組，如分別在不同部位同時注射聯(lián)合疫苗中所含有的單價組份疫苗的對照。

　　臨床試驗中應(yīng)觀察接種后的不良反應(yīng)，還應(yīng)進行跟蹤研究，應(yīng)在臨床研究開始前確定不良反應(yīng)的判定標準和跟蹤研究方案。一般滅活疫苗應(yīng)進行7天的主動監(jiān)測，活疫苗應(yīng)進行14天以上的主動監(jiān)測，還應(yīng)進行30 天電話隨訪或采用調(diào)查表的方式。觀察的不良反應(yīng)包括全身反應(yīng)如：發(fā)熱、不適、頭疼、嘔吐、哭鬧，及紅斑、硬結(jié)、疼痛、 觸痛等局部反應(yīng)；以及不常見或罕見的不良反應(yīng)。

　　（二）免疫原性研究

　　應(yīng)當對聯(lián)合疫苗中所有組分的免疫原性進行研究。應(yīng)當將聯(lián)合疫苗的免疫原性與分別同時接種在不同部位的各單價組分疫苗的免疫原性進行比較，如果聯(lián)合疫苗中的某些組分是已獲生產(chǎn)文號的，那么，該已獲得文號的單組份疫苗可以用于免疫原性研究的對照組。聯(lián)合疫苗中的每一種血清型或組分在聯(lián)合疫苗中均應(yīng)有相應(yīng)的免疫原性要求。在臨床試驗方案中應(yīng)包含各組分免疫原性與其保護性之間關(guān)系研究的要求。

　　評價每一組分的免疫原性的參數(shù)是非常關(guān)鍵的，應(yīng)廣泛征求有關(guān)專家的意見，確定評價疫苗免疫原性的參數(shù)以及各參數(shù)的合格標準。一般來講，抗體水平和血清陽轉(zhuǎn)對于臨床保護性只起一定的參考作用。應(yīng)當注重抗體的質(zhì)量而不是僅僅是抗體的量，例如，抗體的親和性、功能、抗原決定族的識別位點以及其他規(guī)定的參數(shù)對確定應(yīng)答抗體的質(zhì)量是非常重要的。

　　免疫原性比較研究的目的旨在證明聯(lián)合疫苗接種后各組份疫苗的免疫應(yīng)答與同時分別接種聯(lián)合疫苗中的各單組份疫苗后的免疫應(yīng)答之間是否有顯著區(qū)別。研究的設(shè)計應(yīng)能證明聯(lián)合疫苗與原單價疫苗的免疫原性相一致，應(yīng)能證明和排除在臨床上抗體幾何平均滴度（GMTs）和/或者血清陽轉(zhuǎn)率方面的顯著性差別，同時應(yīng)考慮測定方法和受試者的內(nèi)在變化的影響。臨床試驗方案中應(yīng)對聯(lián)合疫苗接種后各單組份疫苗的免疫應(yīng)答與直接接種單組份疫苗的免疫應(yīng)答可能存在的顯著差別作出明確的定義，在試驗假設(shè)中應(yīng)清楚地表明哪些差別是將被排除的，并且以此來計算出受試人群的大小。應(yīng)當對任何觀測到的差別評價其臨床相關(guān)性，對每一個組分在免疫劑量或免疫程序上的改變，均應(yīng)有臨床數(shù)據(jù)作為其改變的依據(jù)。

　　用于臨床驗證的制品批數(shù)可以比用于生產(chǎn)一致性研究的批數(shù)少。但是，在某些情況下，例如制品中含有未獲生產(chǎn)文號的組分時，臨床驗證時應(yīng)使用更多的批數(shù)，應(yīng)至少有一批是用于生產(chǎn)一致性研究的制品，并且，應(yīng)采用制備聯(lián)合疫苗的同批單價疫苗進行接種的對照組試驗，以避免由于批間的不同而引起免疫原性的不同。對所使用的疫苗批間的差異要進行分析。因此，臨床試驗也應(yīng)考慮以上因素對臨床研究結(jié)果的影響。

　　（三）有效性研究

　　每一組分的有效性均應(yīng)經(jīng)過臨床試驗得到證明。比較理想的臨床試驗是前瞻性的、隨機的和有對照的。評價有效性所使用的判定終點，一般是疾病的發(fā)病率，但也可以是已經(jīng)確定了的“保護性相關(guān)指標”。疫苗有效性試驗中所使用的保護性相關(guān)指標，應(yīng)為經(jīng)過充分驗證的和臨床試驗證明的可以保護該疾病的實驗室參數(shù)。如果一個免疫學的保護性相關(guān)指標在能夠確定質(zhì)和量的相互關(guān)系時，就可以代替流行病學指標。具有一定滴度的某些類別的抗體與保護性具有相關(guān)性，例如免疫后破傷風抗毒素的中和抗體單位大于0.01IU/ml時，則認為可保護受試者免于破傷風的發(fā)生。

　　如果聯(lián)合疫苗中的單組分疫苗的保護性效力是經(jīng)過證實的，這一研究結(jié)果可以作為參考資料來支持聯(lián)合疫苗的研發(fā)。在臨床試驗時，可采用與單價組份疫苗的橋接試驗來比較聯(lián)合疫苗中這組份疫苗的保護性效力。

　　如果聯(lián)合疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體水平低于單價組分疫苗，但仍能達到保護性作用的，應(yīng)提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)或資料證明其保護的有效性及持久性。

　　在評價制品有效性時，一般不選用病例對照試驗（case-control）。由于該試驗在許多方面有可能產(chǎn)生偏差，因此，在采用該方法時，應(yīng)在試驗方案中詳盡地闡述如何降低偏差和采取的糾正措施。

　　一般來說，測定多價血清型的聯(lián)合疫苗中每一個血清型的效力是比較困難的。因此可采用相應(yīng)的替代方案。應(yīng)當根據(jù)目標人群中相應(yīng)血清型疾病的發(fā)病率設(shè)計此類疫苗有效性的臨床試驗。如果臨床試驗的判定終點是以該疫苗所預(yù)防的各型疾病發(fā)病率的總和時，該試驗應(yīng)當具有相當?shù)囊?guī)模，即確保發(fā)病率低的血清型仍能有一定數(shù)量人群的數(shù)據(jù)，以評價其有效性。

　　對于多價血清型的聯(lián)合疫苗，由于缺乏足夠數(shù)量的病例而不能夠進行臨床有效性的評價時，在某些情況下，可以用免疫原性的數(shù)據(jù)推斷其有效性。如果在臨床上已經(jīng)證明了血清學和有效性存在著相關(guān)關(guān)系時，可以使用免疫原性數(shù)據(jù)推斷其有效性。

　　（四）數(shù)據(jù)統(tǒng)計

　　臨床研究中很重要的一個問題是確定受試人群的大小。現(xiàn)在尚無計算聯(lián)合疫苗臨床試驗受試人群大小的標準，評價主要基于統(tǒng)計學、臨床學和基礎(chǔ)科學的評價結(jié)果。

　　多數(shù)聯(lián)合疫苗的臨床試驗均以在不同部位分別接種各組分疫苗或接種各組份混合后疫苗為試驗的對照組，受試者應(yīng)當隨機地分配到各疫苗組。按照受試者的特性（如：年齡或者到達試驗點的日期）分組的方法不符合隨機分配的原則。

　　為了證明聯(lián)合疫苗與單價疫苗等效性的臨床試驗，應(yīng)當設(shè)計一個拒絕有區(qū)別的假設(shè)試驗，而不是傳統(tǒng)意義上的無區(qū)別的“無效”假設(shè)試驗。為了證明發(fā)生率和比例相同或等價時，采用單側(cè)檢驗是適宜的，因臨床試驗的目的在于證明注射聯(lián)合疫苗與分別注射的單價組分疫苗無明顯差異。

　　如果要證明聯(lián)合疫苗優(yōu)于分別注射的單價組分疫苗，應(yīng)當設(shè)計一個檢驗差異的臨床試驗，而不是一個檢驗等價的試驗。

　　對于免疫應(yīng)答，一般分析接種后的GMT或GMR（應(yīng)答率的幾何均值），通常是為了排除聯(lián)合疫苗和分別注射的單價組分疫苗間在臨床上有意義的差別。對于要排除事先規(guī)定的差別的臨床試驗規(guī)模，應(yīng)計算考慮受試人群的大小。

　　如果聯(lián)合疫苗的免疫應(yīng)答未顯示明顯地低于分別注射的單價疫苗，那么，可采用雙側(cè)的生物等價檢驗來分析GMT.理想的設(shè)計是聯(lián)合疫苗誘導所產(chǎn)生的抗體滴度既不比預(yù)先規(guī)定的量太低也不會太高。

　　臨床結(jié)果分析時，應(yīng)同時進行血清的陽轉(zhuǎn)率與抗體滴度的分析比較研究。在沒有保護性替代指標的情況下，如果沒有陽轉(zhuǎn)率與GMT間的分析和評價是很難得出結(jié)論。如果已經(jīng)建立了保護性免疫的替代指標，在評價聯(lián)合疫苗和分別注射的單價組分疫苗間的差別時，就應(yīng)當考慮保護性免疫替代指標。

　　對于評價常見的不良反應(yīng)，試驗組中聯(lián)合疫苗為一個接種部位，而對照組為二個或多個接種部位，這種對比分析試驗不是雙盲的。因此，在分析時應(yīng)將單部位接種的反應(yīng)（聯(lián)合疫苗組）與多部位接種（對照組）當中反應(yīng)最嚴重的一點進行比較。還應(yīng)考慮到在個體內(nèi)的不同組分間的相互作用。

　　對于不常見的不良反應(yīng)的評價，臨床試驗中應(yīng)根據(jù)疫苗目標人群的大小來確定受試人群的大小。

　　對于罕見的不良反應(yīng)的評價，受試人群的規(guī)模應(yīng)當足夠大，如果未觀察到不良反應(yīng)，可認為在目標人群中發(fā)生的可能性也很低。

　　總之，聯(lián)合疫苗的研發(fā)和臨床試驗不同于一般疫苗，除一般要求以外，還應(yīng)充分考慮多種組分聯(lián)合后產(chǎn)生的相互作用對聯(lián)合后疫苗的安全性和有效性的影響，以及是否產(chǎn)生毒性逆轉(zhuǎn)或重組。在臨床試驗時，應(yīng)采用聯(lián)合疫苗中各組分分別但同時接種作為對照組，由于對照組是多部位接種，給不良反應(yīng)的評價帶來了困難，同時還應(yīng)充分考慮各組分在體內(nèi)的相互作用而產(chǎn)生的影響。因此，不能簡單地采用一種固定的模式研究聯(lián)合疫苗的安全性和有效性。

多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導原則

前言

　　多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預(yù)測的某段抗原表位的氨基酸序列，通過化學合成技術(shù)制備的疫苗。傳統(tǒng)疫苗一般由兩種方式制備，一種為能誘發(fā)免疫力卻不致病的減毒疫苗，例如黃熱病、脊髓灰質(zhì)炎和麻疹疫苗或卡介苗；另一種為滅活疫苗（例如百日咳桿菌、狂犬病毒、傷寒桿菌）。多肽疫苗由于完全是合成的，不存在毒力回升或滅活不全的問題。特別是一些還不能通過體外培養(yǎng)方式獲得足夠量的抗原的微生物病原體。有些雖能進行體外培養(yǎng)，但這些病原體有潛在致病性和免疫病理作用等涉及安全性與有效性的問題。多肽作為體內(nèi)引起效應(yīng)細胞免疫應(yīng)答形成的免疫原，將成為一種新型的疫苗，但還有很多理論和技術(shù)問題要繼續(xù)研究，目前尚無多肽疫苗獲準上市。因此，應(yīng)采取適當可行的途徑對這種潛能疫苗進行生產(chǎn)及質(zhì)控，并在其生產(chǎn)過程中積累經(jīng)驗，為此，應(yīng)加強咨詢和論證，以便提出一個確保安全有效而又適合實際的申報資料。同時，對每個方案中各個階段的操作過程、中間及最終產(chǎn)品的制備，務(wù)必制定標準操作規(guī)程和質(zhì)控標準，并予嚴格實施。

一、多肽疫苗的化學合成

　　首先應(yīng)該確定天然抗原的氨基酸序列，選擇和確定尋找有效肽段的方法，并尋找該肽段所針對的抗原決定簇。

　　其次應(yīng)選擇合適的合成方法。合成中等大小的多肽也會涉及眾多反應(yīng)，每加入一個氨基酸需多次反應(yīng)，在一個氨基酸的α氨基與另一個氨基酸的羧基縮合形成肽鏈之前，必須使其中一個形成高反應(yīng)的活化狀態(tài)，這個選擇自然落到羧基上，合成因而從C到N端。如果A氨基酸的C端與B氨基酸的N端縮合產(chǎn)生2肽A－B，則A的N端及B的C端必須保護起來，才能轉(zhuǎn)化成在A－B之間形成特異性肽的形式。此外，氨基肽的側(cè)鏈基團也能與活化羧基反應(yīng)，因此也必須保護起來。這些側(cè)鏈保護基團必須能耐受除去α－氨基保護基團的條件，這樣才能生成新的氨基基團使肽鏈得以繼續(xù)延長。合成結(jié)束后必須除去所有的保護性基團以得到所需的多肽。多肽的合成循環(huán)包括了一系列的反應(yīng)，每一循環(huán)生成一個新肽鍵。

　　主要有兩個合成策略：片段濃縮法和固相合成法（merrifield法）。片段濃縮法是經(jīng)典的

　　合成技術(shù)。首先合成數(shù)條小肽，經(jīng)純化和去保護后結(jié)合成較長的肽，直到最后所需的序列。

　　在固相合成法是將肽鏈一端結(jié)合于固相載體上的方法。通過在N－末端逐步加上氨基酸的方法合成肽段。

　　另外也引入一些新進展包括改良的保護基因、新的固相載體、脫保護及側(cè)鏈功基保護等新方法。在疫苗合成領(lǐng)域中，由于肽鏈聯(lián)接或裝配到需要的結(jié)構(gòu)（TADPs）及免疫原性構(gòu)架（MAPs）所用技術(shù)的引進，加上肽鏈經(jīng)脂質(zhì)或碳水化合物的修飾作用，使得合成問題變得更加復雜。目前多應(yīng)用固相法，特別是在選擇和確定有效抗原表位研究方面，是合成多肽疫苗的一條可供選擇的途徑。

二、多肽疫苗的生產(chǎn)工藝及質(zhì)控

　　（一）應(yīng)提供研制某一疫苗的詳細資料，包括選擇特定抗原決定簇的理由、對抗原決定簇的檢定，以及對載體、表位連接、結(jié)合劑、肽的呈遞方式及佐劑等的選擇理由及其相應(yīng)證據(jù)。

　　（二）應(yīng)說明每條肽段所針對的抗原表位。內(nèi)容包括對每個表位來源的說明，當不止一個表位時，應(yīng)說明把不同表位相互結(jié)合到一個已知序列內(nèi)的理由，此外還應(yīng)對表位的類型（B、Th、Tc等）及特殊組合方式進行說明。

　　（三）應(yīng)當提供肽鏈合成的詳細資料。內(nèi)容包括：原料的來源和特性、使用的方法學、氨基酸的連接和脫保護，進入下一步連接的判斷標準，任何加入的修飾基團（例如糖基化，脂質(zhì)化）的詳細情況。如果采用了液體合成法，應(yīng)當提供包括對中間體有特殊說明的流程圖。

　　（四）如果肽單體為中間產(chǎn)物，應(yīng)當對其分離鑒定并提供下述確證依據(jù)。

　　1．主要肽順序與預(yù)期的結(jié)構(gòu)相同，例如，目標氨基酸按需要的順序排列；修飾（脂化及糖基化）情況；

　　2．對肽單體中的主要雜質(zhì)（可能情況下對次要雜質(zhì)）應(yīng)分離鑒定。驗證純度時應(yīng)采用多種技術(shù)對其理化特性盡可能多地檢查，特別要注意檢測生產(chǎn)或純化過程中可能加入的物質(zhì)；

　　3．連續(xù)多批產(chǎn)品的肽質(zhì)量應(yīng)保持一致。

　　（五）對肽單體或肽衍生物應(yīng)建立適當?shù)臉藴省﹄牡募兌取⒖傠s質(zhì)、每種主要及次要雜質(zhì)都應(yīng)規(guī)定限度要求。

　　（六）如果不能對肽單體進行全面鑒定，應(yīng)提供相應(yīng)說明。

　　（七）應(yīng)對肽的穩(wěn)定性進行評價，并制定適當?shù)馁A存期。

　　（八）偶聯(lián)物

　　偶聯(lián)物中多肽及其它成分除了達到適當?shù)囊笸猓€應(yīng)符合下列規(guī)定：

　　1．對偶聯(lián)物進行驗證，其含量應(yīng)能重復并保持一致，當不止一種肽結(jié)合到同一載體上時，應(yīng)對每一種肽所占比例進行控制并能重復制備；

　　2．最大限度降低副反應(yīng)并控制到能重復的水平，這些副反應(yīng)包括載體之間的交聯(lián)，載體表面濃縮的未結(jié)合的偶聯(lián)劑，以及對未參與結(jié)合的偶聯(lián)劑的滅活等；

　　3．有證據(jù)表明偶聯(lián)物未改變抗原序列；

　　4．應(yīng)當考慮機體對載體蛋白或其誘導免疫反應(yīng)的潛在臨床影響；

　　5．當同一載體用于幾種疫苗或一種疫苗的幾種不同表位時，應(yīng)考慮特異性表位抑制的可能性，并進行調(diào)查；

　　6．應(yīng)當最大限度地降低殘余溶劑或副產(chǎn)品的含量，并設(shè)定相應(yīng)限定要求；

　　7．應(yīng)當設(shè)定適宜的可接受的標準，合適的參考制品可能是必要的。

　　（九）載體

　　肽可以聯(lián)接或結(jié)合到載體上，選擇載體時應(yīng)謹慎，因為對載體的免疫應(yīng)答可能會掩蔽對肽的免疫應(yīng)答。目標人群中的一部分可能對某一載體存在過敏反應(yīng)或某些載體有刺激自身免疫的危險，應(yīng)避免選擇這些載體。載體應(yīng)有自已的檔案材料及相應(yīng)標準，它包括：載體的鑒定，生產(chǎn)一致性的證據(jù)，蛋白質(zhì)的安全性以及與蛋白質(zhì)、脂多糖、多聚體、脂質(zhì)體等相關(guān)的一些特征試驗。例如，聚合體和脂多糖應(yīng)當具有可重復的分子量范圍，脂多糖具有一致的單糖組分，脂質(zhì)體具有一致的結(jié)構(gòu)、組分。對不同成分及雜質(zhì)應(yīng)鑒別定性并加以定量測定，對于生物來源的載體應(yīng)當采取措施，確保檢測不出感染因子。

　　（十）聚合、烷化或載體合成肽

　　無論是與聚合肽構(gòu)架（例如MAP）結(jié)合的肽，或肽單體合成后再進一步形成的聚合肽或烷化肽（例如，通過未端半胱氨酸的氧化作用），也無論是單一肽鏈或與其它肽鏈的聚合，都應(yīng)有相應(yīng)的證據(jù)，表明反應(yīng)過程達到了最后可重復的階段。

　　（十一）佐劑、防腐劑及其他添加成分為方便操作、增強穩(wěn)定性、延長保存期以及修飾免疫原的類型和免疫原性，原則上可在免疫原中選擇添加許多成分。這些成分其特性變化較大，從小分子物質(zhì)到大分子菌體成分及合成聚合物等各不相同，有作為非特異免疫增強劑的成分，特異性免疫激活作用的成分及直接作用于不同免疫細胞的成分。其中許多會產(chǎn)生自身的毒性，而且可能因與抗原聯(lián)合使用而顯著改變免疫反應(yīng)，從而引起安全性方面的其它顧慮。傳統(tǒng)佐劑是在礦物膠基礎(chǔ)上制成-氫氧化鋁、磷酸鋁或磷酸鈣，到目前為止批準使用的佐劑鮮為他類。對已獲批準的以鋁鹽及鈣鹽為基礎(chǔ)的佐劑，其標準應(yīng)達到藥用等級（不含重金屬離子，質(zhì)量恒定，具有恒定的結(jié)合特征）。由于滅菌可能會改變佐劑的結(jié)合特征，對不同批次佐劑應(yīng)以可重復、持續(xù)的方式處理。對于添加劑，應(yīng)提供所有成分的明確說明，闡述使用的理由。每種成分應(yīng)具有適當?shù)姆治鰳藴室螅K配方中應(yīng)限定不同成分混合物的含量。此外，應(yīng)全面評價配方的抗原及毒性特征，特別注意不同成分的混合可能會導致抗原發(fā)生不良的修飾作用。

　　如果在疫苗中加入防腐劑，應(yīng)確定其含量，該用量應(yīng)既不對疫苗中的各個成分產(chǎn)生不良作用，也不應(yīng)引起人體副反應(yīng)。單劑量制劑不應(yīng)添加防腐劑。

　　（十二）穩(wěn)定性

　　進行充分的穩(wěn)定性研究是研制疫苗的一項重要內(nèi)容。因此應(yīng)確定配方的穩(wěn)定性，并以此建立合適貯存條件下的最大貨架期。為確保每種成分的有效性，應(yīng)對到期產(chǎn)品的免疫原性及安全性進行實時穩(wěn)定性研究。

三、產(chǎn)品的質(zhì)量與檢定要求

　　保證多肽制品的一致性極其重要，應(yīng)廣泛使用分析技術(shù)。應(yīng)對疫苗生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)和步驟的各種成分（無論以單獨或偶聯(lián)方式）均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標準，包括原材料質(zhì)控，加工過程的質(zhì)控和終產(chǎn)品的質(zhì)控，以保證終產(chǎn)品安全有效。

　　除應(yīng)符合常規(guī)的安全試驗（如無菌、熱原試驗及異常毒性試驗），針對合成多肽的特點應(yīng)考慮：

　　（一）純度：高效液相色譜（HPLC）、毛細管電泳（CE）、陽離子或陰離子色譜、等電聚焦，依據(jù)分子大小的鑒別技術(shù)（分子篩層析，還原、非還原SDS－PAGE 電泳），根據(jù)疏水性的鑒別技術(shù)（反相或疏水作用層析）等相應(yīng)分析的技術(shù)。

　　（二）理化性質(zhì)均一性的確定：氨基酸序列分析（N/C末端）、肽圖、MS以及氨基酸組成（AAA）分析。

　　（三）產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)

　　（四）與生產(chǎn)過程相關(guān)的雜質(zhì)

　　（五）人為修飾的檢測

　　（六）效力試驗

　　效力試驗并非一定反映出在人體內(nèi)的作用機制或功能活動。但是在合適情況下應(yīng)包括有關(guān)疫苗功能的適宜試驗。效力試驗的主要目的是通過測定生物活性的方法，確認各批之間的一致性。因此應(yīng)考慮活體外及活體內(nèi)免疫性和抗原性測定試驗。這種試驗應(yīng)將制品同時與參考品做比較，而且試驗結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計學檢驗。由于疫苗的作用模式會改變，有關(guān)這類試驗的細節(jié)應(yīng)區(qū)別對待，不能一概而論。但是應(yīng)確定試驗結(jié)果的可信限，以便確定方法本身固有的變異，為每批制品的平均值提供一個可信限幅度，并由此確定接受的標準及限值，為此應(yīng)建立適宜的參考制劑。

　　（七）生物效價測定

　　（八）建立內(nèi)部參考品：建立適當?shù)膮⒖计穼崿F(xiàn)這些標準也是必要的。此外，選取合適的一批中間產(chǎn)品及終產(chǎn)品（最好是選擇經(jīng)過臨床評價的制品），就其化學成分、純度及生物學活性進行全面檢定，而后保存下來作為化學或生物參考品，可依此制定每批產(chǎn)品的標準要求。

　　（九）佐劑、保護劑及其他添加成分：如果使用鋁或鈣的化合物作為佐劑，其用量不應(yīng)超過常規(guī)用量范圍（每人用劑量的鋁佐劑含量應(yīng)不超過1.25mg，鈣佐劑含量應(yīng)不超過1.3mg）。對保護劑及其他添加劑應(yīng)確定相應(yīng)的質(zhì)量控制標準。

四、臨床前安全評價

　　臨床前安全評價的主要目的是確定新藥制品是否引起意外或不良的效應(yīng)。但推薦供化學藥使用的臨床安全及毒性試驗對于合成肽疫苗不甚相關(guān)。動物毒性試驗會產(chǎn)生種屬特異性方面的問題，因此，多肽疫苗的安全評價應(yīng)考慮諸多因素。有必要采取靈活的方法評價合成肽疫苗的臨床前安全性，應(yīng)當充分考慮使用合成肽疫苗所產(chǎn)生不良免疫病理反應(yīng)的各種可能性。

　　必須確保使用的肽序列不具有明顯的不良藥理活性。因此，應(yīng)篩查單體肽固有的毒性或藥理作用。也應(yīng)考慮由聚合或偶合而產(chǎn)生的作用的可能性。一種多肽可能有意想不到的次要活性，而這一活性可能會由于上述反應(yīng)而得到放大并產(chǎn)生危害。因此，應(yīng)全面檢查多肽及其偶合物的藥理活性。

　　抗肽抗體可能與人體組織產(chǎn)生意想不到的交叉反應(yīng)，也可引發(fā)自身免疫反應(yīng)。因此，應(yīng)使用人體組織測定疫苗的最后配方及佐劑是否產(chǎn)生意外的交叉抗體。偶合或聚合反應(yīng)能產(chǎn)生新的表位，而僅僅評價肽單體不能解決該問題。毫無疑問安全試驗是必要的，但選擇何種試驗則應(yīng)依靠實際情況而定，并應(yīng)咨詢有關(guān)質(zhì)控當局。對于臨床前安全性試驗，應(yīng)廣泛使用生物學、生物化學、免疫學、毒理學及組織病理學等適當?shù)难芯考夹g(shù)，在適當?shù)那闆r下，可采用多個相關(guān)劑量并包括急性及慢性試驗。

結(jié)合疫苗質(zhì)量控制和臨床研究技術(shù)指導原則

前言

　　結(jié)合（以蛋白為載體的細菌多糖類）疫苗是指采用化學方法將多糖共價結(jié)合在蛋白載體上所制備成的多糖-蛋白結(jié)合疫苗，用于提高細菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、腦膜炎球菌結(jié)合疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗等。結(jié)合疫苗的生產(chǎn)及質(zhì)量控制應(yīng)符合國家有關(guān)規(guī)定和中國藥品GMP要求。其制造及檢定方法的標準操作規(guī)范、驗證和修訂應(yīng)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準或認可。

　　本原則適用于多糖-蛋白結(jié)合疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制和臨床研究。

　　應(yīng)根據(jù)疫苗生產(chǎn)用菌種的生物安全防護等級分類，在相應(yīng)的生物安全防護條件下進行各項生產(chǎn)用菌種的操作。生產(chǎn)操作和質(zhì)量檢驗人員必須經(jīng)過嚴格的職業(yè)培訓，并應(yīng)采取適宜的防護措施，例如免疫接種相應(yīng)的疫苗。必須制訂詳細的和切實可行的緊急處理措施，確保一旦發(fā)生細菌溢出、滲漏等其它細菌播散事故時，可最大限度地控制和避免危害人身和環(huán)境的安全。

一、結(jié)合疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制原則

　　（一）多糖抗原生產(chǎn)的質(zhì)量控制

　　1．生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基：生產(chǎn)用菌種須經(jīng)國家食品藥品管理當局批準方可用于制備多糖抗原。應(yīng)采用種子批系統(tǒng)。從原始種子批傳代、擴增后凍干保存為主種子批。從主種子批制備工作種子批。主種子批和工作種子批菌種的各種特性應(yīng)與原始種子批一致。工作種子批用于生產(chǎn)。應(yīng)驗明各級菌種庫菌種的記錄、來源、歷史和生物學特性，并進行各項必需的生物學特性鑒定。如：形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)和血清學試驗等。必要時可采用核磁共振（1H或13C）、核苷酸序列分析等特殊鑒定方法。

　　培養(yǎng)基成分應(yīng)盡可能避免使用動物源性材料，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性材料。

　　應(yīng)通過監(jiān)測細菌的生長速度、pH值和多糖的產(chǎn)量，保證不同批或不同培養(yǎng)罐中細菌生長的均一性。

　　應(yīng)在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣進行純菌試驗，可采用革蘭氏染色鏡檢和平皿劃線接種培養(yǎng)等。若發(fā)現(xiàn)染有雜菌應(yīng)廢棄。

　　2．精制純化多糖：精制純化多糖應(yīng)逐批進行鑒別試驗、純度和分子大小測定。應(yīng)制定多糖純度的合格標準。通常應(yīng)在－20℃以下儲存精制純化后的多糖，以維持其穩(wěn)定性。為控制精制純化多糖的質(zhì)量所進行的測定包括：

　　（1）鑒別試驗：通常應(yīng)用血清學反應(yīng)進行多糖鑒別試驗；

　　（2）分子大小分布：應(yīng)采用凝膠過濾或高效液相色譜（HPLC）等適宜方法測定純化多糖的分子大小分布，并建立相應(yīng)的KD 值合格標準，不同批純化多糖的KD 值應(yīng)保持一致；

　　（3）采用凍干保存的純化多糖，其水分含量應(yīng)合格；

　　（4）多糖含量：應(yīng)采用特定的方法測定糖含量，如磷含量測定、唾液酸含量測定和核糖含量測定等方法；

　　（5）雜蛋白含量：應(yīng)采用Lowry 法、BCA法等方法測定純化多糖中蛋白雜質(zhì)的含量，應(yīng)同時采用相應(yīng)的國家標準品作蛋白測定對照；

　　（6）核酸雜質(zhì)含量：應(yīng)采用紫外260nm測定等方法測定純化多糖中核酸雜質(zhì)含量；

　　（7）應(yīng)采用家兔熱原試驗或鱟試驗定量測定方法測定純化多糖中的熱原質(zhì)及內(nèi)毒素含量；

　　3．修飾處理后的多糖：多糖與載體蛋白結(jié)合前通常需先經(jīng)化學修飾，即活化（例如可采用溴化氰活化多糖）。應(yīng)采用適宜的方法檢測化學修飾的效果， 即活化度測定；另外，可采用凝膠過濾或高效液相色譜等適宜方法測定活化后多糖的分子大小分布，以確保多糖－蛋白結(jié)合反應(yīng)的批間一致性。

　　（二）載體蛋白的質(zhì)量控制

　　載體蛋白生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基的質(zhì)控原則與多糖抗原生產(chǎn)用菌種和培養(yǎng)基的質(zhì)控原則相同。

　　結(jié)合疫苗常用的載體蛋白包括有：破傷風類毒素、白喉毒素無毒變異蛋白（CRM197）和B群腦膜炎球菌外膜蛋白等。

　　如果采用已有國家標準的破傷風類毒素和白喉類毒素等作為載體，其各項質(zhì)量指標應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》的要求，尤其要注意確保載體蛋白的純度。

　　采用國外已通過臨床試驗驗證的安全有效的CRM197 蛋白、B群腦膜炎球菌外膜蛋白等作為載體，應(yīng)參照國外相應(yīng)的質(zhì)量標準，對其特性和純度進行質(zhì)量復核：（1）可采用HPLC法等適宜方法測定CRM197 蛋白的純度，其純度應(yīng)在90% 以上；應(yīng)確保CRM197 蛋白的氨基酸序列正確無誤。如果與白喉類毒素在同一車間生產(chǎn)，應(yīng)建立能區(qū)分CRM197 蛋白和白喉毒素的方法，并應(yīng)符合中國藥品GMP要求。（2）可采用SDS-PAGE 圖譜分析測定純化后B群腦膜炎球菌外膜蛋白復合物的組成；其脂多糖的含量不應(yīng)超過8%；家兔熱原試驗應(yīng)合格。

　　采用上述以外的其它蛋白作為載體，應(yīng)參照上述蛋白載體質(zhì)量標準要求，結(jié)合其自身特點建立相應(yīng)的質(zhì)量標準，并進行嚴格的質(zhì)量檢測和復核。

　　可采用血清學方法進行載體蛋白的鑒別試驗。用于檢測載體蛋白理化特性的常用方法包括：SDS-PAGE 圖譜分析、等電聚焦分析、HPLC測定、氨基酸分析、氨基酸序列分析、旋光度測定、熒光分光光譜分析、肽圖譜分析和質(zhì)譜分析等。

　　如果載體蛋白與多糖結(jié)合前需進行活化處理，應(yīng)建立測定蛋白活化程度的方法，以確保批與批之間的一致性。

　　（三）多糖-蛋白結(jié)合物原液的質(zhì)量控制

　　不同的結(jié)合疫苗可能采用不同的多糖-蛋白結(jié)合工藝，但均需要進行多步反應(yīng)。為了確保多糖-蛋白結(jié)合物的穩(wěn)定性、安全性和批間一致性，應(yīng)建立相應(yīng)的質(zhì)量控制方法。由于結(jié)合反應(yīng)可能影響多糖的結(jié)構(gòu)，多糖-蛋白結(jié)合后（單價結(jié)合物未混合前）應(yīng)進行多糖的鑒別試驗。此外，還應(yīng)對純化后的多糖-蛋白結(jié)合物進行以下檢測：

　　1．應(yīng)采用適宜的檢測方法，確證多糖-蛋白結(jié)合物原液經(jīng)過純化后，多糖-蛋白結(jié)合反應(yīng)中所使用的試劑（如溴化氰、ADH和EDAC等化學試劑）已被清除；

　　2．如果化學結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生了獨特的結(jié)合標志（例如某一獨特的氨基酸），可通過測定該標志物定量分析多糖—蛋白結(jié)合反應(yīng)的程度，也可將結(jié)合物中多糖/蛋白比作為判斷結(jié)合反應(yīng)的一個間接標志；

　　3．殘留的活化功能基團：結(jié)合物中多糖或載體蛋白均應(yīng)不再殘留有活化后未結(jié)合的功能基團；

　　4．結(jié)合及未被結(jié)合的多糖含量：結(jié)合多糖為結(jié)合疫苗中的免疫保護抗原。未被結(jié)合的游離多糖不得超過一定比例。可直接測定游離多糖的含量，或先將結(jié)合多糖和未結(jié)合多糖分離后測定結(jié)合多糖的含量。將結(jié)合多糖和游離多糖分離的方法包括沉淀、凝膠過濾、超濾或超離等方法；

　　5．蛋白含量：可采用HPLC等適宜方法測定多糖-蛋白結(jié)合物中結(jié)合蛋白和未結(jié)合蛋白的含量；

　　6．多糖/蛋白比：分別測定結(jié)合物中結(jié)合多糖和結(jié)合蛋白的含量；

　　7．分子大小分布：結(jié)合物原液應(yīng)逐批進行相對分子大小的測定，可采用凝膠過濾或液相色譜等方法進行測定，所建立的方法應(yīng)能將多糖-蛋白結(jié)合物與未結(jié)合的多糖、蛋白區(qū)分開；

　　8．無菌試驗應(yīng)合格；

　　9．結(jié)合物中載體蛋白的毒性試驗：如果采用破傷風類毒素和白喉類毒素作為載體蛋白，應(yīng)按現(xiàn)行版《 中國藥典》的要求，對多糖-蛋白結(jié)合物進行破傷風類毒素和白喉類毒素的毒性試驗；

　　10．可對結(jié)合物進行熱原試驗及內(nèi)毒素含量測定。

　　疫苗原液在稀釋、分裝前可加入適宜和適量的佐劑、防腐劑及保護劑。多價結(jié)合疫苗既可在各單價結(jié)合物原液混合后加入佐劑、防腐劑及保護劑，也可在各單價結(jié)合物原液中加入佐劑、防腐劑及保護劑后再混合。稀釋分裝前無菌試驗應(yīng)合格。

　　（五）成品的質(zhì)量檢定

　　1．鑒別試驗：通常采用多糖的特異性抗體進行免疫學測定；

　　2．無菌試